Treść książki
Przejdź do opcji czytnikaPrzejdź do nawigacjiPrzejdź do informacjiPrzejdź do stopki
terminologicznego.Uczącsięgenetyki,azwłaszczagenetykimolekularnej,przyzwyczajamysiędopostrzeganiafunkcjikwasu
deoksyrybonukleinowego(DNA)jakogenomu,podczasgdyfunkcjekwasurybonukleinowego(RNA)widzimyjakofunkcjepośrednika
przenoszącegoinformacjegenetycznezawartewDNAnabiałkowprocesietranslacji(informacyjnyRNA,mRNA)czyteżfunkcje
dostarczycielasurowców(aminokwasów)dobudowypolipeptydówwpolisomach(transportującyRNA,tRNA).Dlategoteż,myśląc
oodcinkachDNAkodującychokreślonebiałkachętniemówimygeny,natomiastocząsteczkachRNApowstałychztranskrypcji
określonychgenówiulegającychswobodnejtranslacjidookreślonychbiałekmówimyraczejotwarteramkiodczytu(ang.
openreading
frame
,ORF).TymczasemgenomwirusamożestanowićRNA,awięcodcinekRNAmożebyćgenem,azarazemotwartąramkąodczytu.
Najkrócejmówiąc,wliteraturzewirusologicznejobatepojęciabywająużywanezamiennieibezrozróżnień;niemachybainnegowyjścia,
ponieważpewnefragmentygenomuróżnychwirusówulegająbezpośredniotranslacjidoodpowiednichbiałek,bezpośrednictwamRNA,
innezaśulegająnajpierwtranskrypcjidosubgenomowegoRNA(sgRNA),któryjestdopierowłaściwąotwartąramkąodczytuiprzenosi
informacjęobudowieodpowiedniegobiałka,pełniącfunkcjeinformacyjnegomRNA.Najliczniejwśródwirusówroślinsąreprezentowane
wirusy,którychgenomemjestpojedyncza,sensowna(plusowa)nićRNA–(+)ssRNA,odanglojęzycznegookreślenia
singlestranded
RNA.Nićsensowna,toznaczytaka,któramożebyćwykorzystanajakoinformacyjnyRNA(mRNA)wprocesietranslacji,czyliinaczej
mówiąc,możebyćprzetłumaczonabezpośrednionaodpowiedniebiałko.Jeszczeinaczejmówiąc,jesttokwasrybonukleinowy,którego
początkiemjestkoniec5'nici(rybozamawolny,niepołączonyzresztąkwasuortofosforowegowęgielwpozycji5'),azakończeniemjest
koniec3'nici(ryboza,któramawolny,niepołączonyzresztąkwasuortofosforowegowęgielwpozycji3').Zgodniezjednązregułprocesu
translacji,procestenpostępujezawszeodkońca5'wkierunkukońca3',azgodniezeuropejskątradycjązapisumowy,zdania,awięcikod
genetycznyzapisujemyodstronylewejkustronieprawej(BergiSinger,1997).Pierwszątrójką(triplet,kodon)nukleotydówjestkodon
początkujący(kodonstartowy)AUGkodującyrównocześniemetioninęjakoaminokwasmontowanywłańcuchupolipeptydowym.
Jednaztrzechmożliwychtrójeknukleotydów–UAG,UAAlubUGAstanowikodonkończący,czylitzw.kodonstop.Kodonystopnie
kodujążadnychaminokwasów,leczstanowiąwyłączniesygnałzakończeniatranslacjiotwartejramkiodczytudookreślonegopolipeptydu.
Liczbaisekwencjanukleotydów,awłaściwieichtrójekwssRNA,stanowiąotożsamościkażdegowirusaisąwobectegowzględniestałe.
Genomywirusówroślinsąstosunkowoniewielkieilicząsobiezregułyod104do105nukleotydów,zaśgenomynp.zwierzątmają
od109do1010parnukleotydów,agenomyroślinsąjeszczewiększeilicząod1010do1011parnukleotydów.Zgodniezpowszechnie
przyjętąterminologiąliczbęnukleotydówpodajesięnaogółwtysiącach(przedrostekkilo-)iwyrażasięjąjakoliczbęwbudowanychzasad
purynowychlubpirymidynowych(ang.
kilobase
,kb)lubpartychzasad(ang.
kilobasepairs
,kbp)Typowamasagenomuwirusaroślinnego
mieścisięwgranicachod4,0×105do4,6×106daltonów(dalton[Da]jesttobezwzględnamasajednegoatomuwodoru).Masa
pojedynczegonukleotyduwynosiokoło330Da,zczegowynika,żemasa1kbwynosiokoło330kDa.
Oczywiście,niejesttak,żewszystkiecząsteczkikwasunukleinowegookreślonegogatunkuwirusasącałkowicieidentyczne.Popierwsze,
wśródwirusówjestwieletakich,którychkompletnygenomjestzapisanynaparu(2–4)różnychcząsteczkachRNA(prawie20%spośród
wszystkichrodzajówwirusówroślinuznanychoficjalnieprzezICTV).Poszczególnefragmentygenomutychwirusówowielosegmentowym
genomieróżniąsięodsiebiewielkościąisekwencjąnukleotydów,iwreszcietreściązapisugenetycznego(zob.podrozdz.3.2).Aleiw
przypadkuwirusówojednosegmentowymgenomielubwprzypadkutegosamegosegmentugenomuwirusaowielosegmentowym
genomie,poszczególnecząsteczkikwasunukleinowegoniesąidentycznezpowoduciąglezdarzającychsiębłędówwreplikacjitego
kwasu.Zagadnieniatezostanąszczegółowoprzedstawionewpodrozdziale3.4omawiającymzmiennośćwirusów.Różnicewwynikach
pomiarówdotyczącychwielkościisekwencjissRNAwirusowegomogąbyćrezultateminnychjeszczezdarzeń:
•RNAmożeulecuszkodzeniuwtrakcieizolowaniagozmateriałuroślinnego,
•RNAwirusowyulegaczasemsamorzutnejczęściowejdegradacjiwkomórkachroślinwnienaruszonychcząstkachwirusa,
•opłaszczeniubiałkiemmożeulecniepełnakopiaRNAwirusa,np.jegosubgenomowyfragment(Palukaitis,1984),
•opłaszczeniubiałkiemwirusamożeulecktóryśzRNAżywicielaicząstkitakiemogąbyćmylniepoczytanezacząstkiwirusa–danetakie
uzyskanowbadaniachnadwirusamizrodzaju
Tymovirus
,wktórychcząstkachznalezionoprawdopodobnietRNAroślinny(Bouleyiin.,
1976)i
Tobamovirus
(Siegel,1971),
•wbadanympreparaciemożebyćobecnyRNAwirusasatelitarnego,niestanowiącygenomubadanegowirusa,
•wtrakciereplikacjiRNApowstajączasemjegoułomneformy(rozdz.3),któremogąbyćobecnewpreparacie,
•rozbieżnościwpomiarachmogąbyćwynikiemtworzeniaprzezRNAwroztworzedrugorzędowych,anawettrzeciorzędowychstruktur;
powstająwtensposóbróżnekonformacyjniecząsteczkiRNA,któremogąulecrozdzieleniuwtokudostatecznieprecyzyjnejelektroforezy
lubnp.wirowaniawgradienciegęstości(DickersoniTrim,1978),
•wpewnychwarunkachRNAwirusowymożetworzyćdimery(AsseliniZaitlin,1978).
DośćważnącechąRNA,wtymrównieżRNAwirusówroślin,jestabsorpcjapromieniowaniaUVwzakresieod230do290nm.SkładRNA
wirusówroślin,azwłaszczaproporcjenukleotydówzawierającychzasadypurynoweipirymidynowedecydujeotym,żemaksimum
absorpcji(wierzchołekkrzywejabsorpcji)leżyzazwyczajwokolicy260nm.PomiarabsorpcjipromieniUVtejwłaśniedługościbywa
używanynawetdooznaczaniazawartościwirusawprzygotowywanychpreparatach(Noordam,1973).NaprzykładA260dla1mg/mlRNA
wirusamozaikitytoniuwroztworzefizjologicznymwynosiokoło29,adlaRNAwirusażółtejmozaikirzepywtychsamychwarunkachokoło
23(Matthews,1991).
Przestrzenneułożenie(konformacja)RNAwcząstcewirusazależygłównieodjegopowiązańzbiałkiemwirusa.WolnyRNAwirusowy,
uwolnionyzokrywybiałkowejnieprzybiera,jakmożnabysięspodziewać,strukturyliniowej,tzn.nićRNAnierozciągasięswobodnie
nacałądługość.Wnormalnychwarunkach(temperaturapokojowa,pHokoło7,0imolowośćroztworuodpowiadająca0,1MNaCl)nanici
RNAwystępująliczne,krótkieodcinkihelikalneprzedzieloneodcinkamirozwiniętejpojedynczejniciRNA,conadajecząsteczcekwasu
nukleinowegodośćzwartąstrukturę.Liczbaidługośćtychsparowanych(połączonychwpary)odcinkówzależy,oczywiście,odskładu
nukleotydowegoRNA,akonkretnieodliczbyidługościkomplementarnychodcinkówmogącychulecsparowaniu.Zależytojednakrównież
odwarunkówzewnętrznych,aprzedewszystkimodtemperatury,pHroztworuizawartościkationów.Całkowitalubczęściowadenaturacja
możenastąpićwwynikuzmianytychwarunków.Wartozauważyć,żezmieniatorównieżfizycznewłaściwościRNA,np.absorpcjęUV.
NależytobraćpoduwagęprzyoznaczaniuwłaściwościfizycznychRNAwirusa(Ehresmanniin.,1987).
Poszczególnerodzajekwasównukleinowychróżniąsięmiędzysobąznaczącocechą,któranazywasięgęstościąpławalną(ang.
buoyant
density
)wroztworachsolicezu.Kiedystężoneroztworychlorkulubsiarczanu(VI)cezupoddajesięwirowaniuwodpowiednichwarunkach,
ciężkiejonycezutworzągradientgęstości.Jeśliwroztworzetakimznajdziesiękwasnukleinowy,lokalizujesięonpowirowaniuwpostaci
prążkawtejwarstwiegradientu,któraodpowiadagęstościągęstościtegokwasu.RNAosadzasięnadniegradientuCsCl,anp.dwuniciowy
DNAzatrzymujesiętamwpostaciprążkawpozycjiodpowiadającejgęstościpławalnejrównejokoło1,69–1,71g/cm3.Gęstośćpławalna
DNAoznaczonawgradienciechlorkucezuzależyodzawartościnukleotydówG+Ci,dziękitemu,wirowaniewgradienciegęstościmoże
byćużytewceluokreśleniaskładunukleotydowegotakiegoDNA.Gęstośćpławalnąróżnychrodzajówkwasównukleinowychwgradiencie
gęstościCs2SO4podanowtabeli1.
Tabela1.Gęstośćpławalnaróżnychrodzajówkwasównukleinowychwyznaczonaprzezwirowaniewgradienciegęstościsiarczanu(VI)
cezu1,56g/cm3(wgMatthewsa,1991)
Rodzajkwasunukleinowego
dsDNA
ssDNA
dsRNA
ssRNA
1,42–1,44
1,49
1,60
1,65
Gęstośćpławalnawg/cm3
UpewnychwirusówzostałyzidentyfikowanecharakterystycznestrukturyzakończeńniciRNA.Jednąztakichstrukturjesttzw.
czapeczka(ang.
cap
)występującanakońcu5'uwirusówzrodzajów
Alfamovirus
,
Bromovirus
,
Cucumovirus
,
Carmovirus
,
Furovirus
,
Hordeivirus
,
Potexvirus
,
Tobamovirus
,
Tobravirus
i
Tymovirus
.Jest
